Полимеразная цепная реакция, также известная как ПЦР, является сложной диагностической технологией, способной обнаруживать инфекционные и вирусные заболевания. Подробнее о том, чем является ПЦР-диагностика, какими преимуществами она обладает и какие этапы проведения ее включает, мы расскажем в этой статье.

В частности, ПЦР-диагностика основывается на увеличении количества конкретной ДНК-части в образце, что позволяет ее определить в микроскопических количествах. Это обеспечивает высокую точность диагностики даже в случае незначительной концентрации заболевания.

Одним из главных преимуществ ПЦР-метода является его высокая чувствительность и специфичность, которые существенно повышают точность результатов тестов. Кроме того, ПЦР-диагностика может быть использована для обнаружения нескольких заболеваний одновременно, что экономит время и средства.

Этапы проведения ПЦР-диагностики включают подготовку образцов, извлечение и очистку ДНК, смешивание ДНК с реактивами, увеличение количества ДНК в циклах и анализ полученных результатов.

Таким образом, ПЦР-диагностика является перспективной и эффективной технологией, которая значительно облегчает задачу постановки диагнозов инфекционных и вирусных заболеваний. Ее преимущества и этапы проведения делают ее достойной конкурентом традиционных методов диагностики.

Описание ПЦР-диагностики: что это такое?

Сегодня ПЦР-диагностика, которая появилась более 30 лет назад, является одним из наиболее точных способов обнаружения инфекций. В такой диагностике используется метод, основанный на принципе многократного увеличения микроскопических концентраций фрагментов ДНК возбудителя в биологической пробе пациента в искусственных условиях. При этом производится амплификация, то есть простое увеличение числа копий молекулы ДНК, которая присутствует только у определенного вида патогенного микроорганизма, который интересует врача. Этот процесс происходит под воздействием ферментов и изменения температуры (от 50 до 95°С) и в результате сложного процесса образуется две молекулы ДНК из одной.

Цикл процесса образования новой молекулы ДНК занимает около 3 минут, и необходимое для достоверного визуального определения количество молекул получается после тридцати-сорока циклов.

С помощью ПЦР также можно производить различные манипуляции с генетическим материалом, такие как сращивание фрагментов ДНК, ввод мутаций и т.д. Использование ПЦР возможно не только для диагностики инфекционных и генетических заболеваний, но и для выделения новых генов и установления отцовства.

Эта диагностика проводится в специальных лабораториях, где используется амплификационное оборудование. Существует множество различных модификаций ПЦР, включая технологии, где используется не только ДНК, но и фрагменты рибонуклеиновой кислоты (РНК). Некоторые из этих модификаций не требуют специального оборудования, а амплификация осуществляется при постоянной температуре.

Одна из таких модификаций - «горячий старт ПЦР», которая подразумевает предварительное прогревание пробирок с амплификационной смесью при температуре 95°С в течение 3–5 минут, чтобы исключить клонирование неспецифических ДНК-фрагментов.

Одна из популярных модификаций ПЦР - мультиплексная амплификация (МПА), которая позволяет проводить исследования сразу нескольких изучаемых фрагментов в одной пробирке. Поэтому, она ускоряет и удешевляет анализ, при этом увеличивает точность исследования методом ПЦР.

Метод ПЦР-диагностики в клинической медицине широко используется во многих областях, включая урогинекологию, неонатологию, службу крови, клинику инфекционных заболеваний, фтизиатрию и пульмонологию.

В урогинекологии, где инфекционные заболевания могут вызвать бесплодие и невынашивание беременности у женщин, метод ПЦР позволяет выявить целый "букет" половых инфекций, включая хламидиоз, микоплазму, уреаплазму, трихомониаз, гарднереллу, кандиду, гонококк и трепонему. Выявление этих инфекций своевременно помогает избежать риска злокачественных заболеваний шейки матки у женщин. Также метод ПЦР используется для выявления вирусов, поражающих урогенитальный тракт обоих полов, в особенности вирус Герпеса и вирус папилломы человека.

В неонатологии метод ПЦР-диагностики позволяет эффективно выявлять наличие неонатальных инфекций как на внутриутробном этапе, так и у новорожденных. К опасным инфекциям относятся цитомегаловирус, токсоплазмы, вирусы краснухи и герпеса, хламидии, микоплазмы.

В службе крови метод ПЦР-диагностики применяется для избежания риска переливания пациентам, инфицированным опасными заболеваниями крови или плазмы, такими как ВИЧ, сифилис, гепатиты. Этот метод превосходит по точности серологические методы, так как он способен выделить даже те инфекции, которые имеют длительный инкубационный период и не определяются при помощи обычных исследований в течение первых нескольких недель.

Клиника инфекционных заболеваний также использует метод ПЦР-диагностики. К ним относятся вирус гепатита, СПИД, сальмонеллез, хеликобактериоз, холера, бруцеллез, туляремия, дифтерия и токсоплазмоз.

В фтизиатрии и пульмонологии метод ПЦР-диагностики позволяет выявить возбудителей атипичных пневмоний и рецидивирующих хронических бронхитов, таких как хламидии и микоплазмы. Кроме того, с помощью этого метода можно не только поставить диагноз, но и провести видовую идентификацию возбудителя, т.е. выявить конкретный штамм. Метод ПЦР также используется для ранней и высокоточной диагностики туберкулеза.

Заметим, что метод ПЦР-диагностики широко используется не только в клинической медицине, но и в криминалистике, экспериментальной медицине, создании генетических паспортов, мониторинге состояния окружающей среды, анализе продуктов питания, фармакологии, ветеринарии.

Оценить наличие возбудителя инфекции в организме иногда не так просто. Именно поэтому ПЦР-диагностика получила такое широкое распространение в медицинской практике. Она является более точным и надежным методом, чем многие другие аналитические способы, и имеет ряд явных преимуществ:

С помощью ПЦР-метода можно непосредственно определить наличие возбудителя инфекции. К примеру, иммуноферментный анализ (ИФА) выделяет только белки-маркеры, которые являются побочным продуктом жизнедеятельности микроорганизмов, и поэтому указывает на наличие инфекции косвенно. С другой стороны, ПЦР-анализ выявляет специфические участки в ДНК и с большой точностью указывает на присутствие конкретной инфекции.

Высокая специфичность ПЦР-диагностики обусловлена тем, что в исследуемом материале выявляются лишь фрагменты ДНК, которые характерны только для определенных возбудителей инфекции. Это исключает вероятность ложных результатов анализа, чего неизбежно можно заблюдать в иммунологических методах, где ошибки возникают из-за перекрестной реакции антигенов.

ПЦР-диагностика также отличается от многих других методов высокой чувствительностью. Она позволяет выявить наличие даже единичных клеток вирусов или бактерий в таких случаях, когда обычными методами сделать это практически невозможно. Например, ПЦР позволяет выявлять всего 10-100 клеток в пробе, в то время как при использовании иммунологических и микроскопических тестов для определения инфекции необходимо иметь не менее 103-105 клеток.

Применение универсальных методов лабораторных исследований, которые диагностируют сразу несколько возбудителей из одной биологической пробы, является еще одним плюсом ПЦР-диагностики. Этот метод может применяться для выявления возбудителей инфекции не только в организме человека, но и в почве, воде, продуктах питания и других материалах.

Скорость получения результатов является еще одним преимуществом ПЦР-диагностики. Поскольку для проведения анализа не нужно производить посев и выделение культуры возбудителя, то и большого количества времени не требуется. Весь цикл от забора биоматериала до получения результатов занимает всего 4-5 часов.

В заключение, метод ПЦР-диагностики известен своей способностью диагностировать трудно культивируемые и некультивируемые формы микроорганизмов, которые могут вызывать скрытые инфекции.

Ограничения ПЦР-диагностики

Несмотря на то, что метод ПЦР-диагностики считается весьма эффективным, у него все же имеются ограничения. Однако их количество настолько мало, что это не может негативно сказаться на популярности и результативности данного метода.

Вероятность амплификации ДНК возбудителя может сохраняться даже после его гибели. При проведении теста для контроля эффективности лечения, необходимо учитывать определенные требования, в частности, проводить его через некоторое время после полного исчезновения возбудителя инфекции в организме – обычно это занимает от 1 до 2 месяцев.

Существует возможность возникновения перекрестной реакции. Праймеры – это фрагменты ДНК, подбираемые на основе знаний о генетической структуре конкретного возбудителя. Теоретически, такой же фрагмент может находиться в геноме других микроорганизмов, генетический код которых еще не расшифрован. Их наличие в тест-пробе может привести к неверному результату анализа.

Микроорганизмы могут изменяться, что может усложнить анализ при помощи ПЦР-диагностики. Иногда возникновение некоторых штаммов возбудителей может не выявляться в результате таких анализов.

В целях снижения рисков возникновения ошибочных результатов разработаны стандарты объемов испытаний тест-систем ПЦР-диагностики, включающие проверку на перекрестные реакции и тестирование всех известных штаммов конкретного возбудителя.

Метод ПЦР имеет несколько этапов, которые проводятся в специальной лаборатории.

Первым этапом является забор биоматериала. Эта процедура проводится с помощью стерильного оборудования и только в стерильные пробирки. Материалом для исследования могут быть различные эпителиальные соскобы, моча, мокрота, кровь, сыворотка, плазма, биологические жидкости, а также биоптаты. Запрещено попадание следов крови в материал.

Следующий этап - хранение и транспортировка биоматериала. Образцы можно хранить на комнатной температуре в течение не более 2 часов или в холодильнике на температуре 2-8°С не более 1 суток. Некоторые биоматериалы допускают замораживание на срок до 2 недель, но оттаивание и повторное замораживание проб запрещено. Если требуется транспортировка, то пробы следует помещать в специальные термоконтейнеры или термосы.

Далее производится выделение ДНК из образца методом твердофазной сорбции. Затем в микроцентрифугу добавляется амплификационная смесь, после чего пробы устанавливаются в программируемый термостат и проводится амплификация. Время проведения зависит от заданной программы и составляет 2-3 часа.

После амплификации проводится регистрация результатов. Фрагмент ДНК, характерный для возбудителя инфекции, выделяется методом электрофореза и образуется светящаяся полоса при облучении ультрафиолетовым излучением. Наличие светящейся полосы в ультрафиолетовом свете свидетельствует о положительном результате.

Интерпретация результатов исследования позволяет сделать выводы о наличии или отсутствии инфекции в организме человека. Количественный результат ПЦР-анализа может помочь врачу определить степень активности заболевания и выбрать соответствующее лечение.

Стоимость ПЦР-диагностики: Что влияет на цену?

Цена на ПЦР-диагностику может очень сильно варьироваться и зависит от нескольких факторов. Как отмечается в статье, стоимость анализа зависит от конкретной инфекции, на которую пациент планирует проверяться, а также от вида анализируемого материала и методики тестирования - качественной или количественной. В разных медицинских клиниках цена за определение одной инфекции может варьироваться от 200 до 800 рублей.

Но это не все затраты, связанные с проведением ПЦР-диагностики. К стоимости анализа добавится оплата за забор биоматериала, которая составляет около 400 рублей. Примерные цены на анализы ПЦР в Москве приведены в таблице 1, где указаны цены на определение ДНК и РНК различных инфекций и вирусов.

Кроме того, многие медицинские центры предлагают провести ПЦР-исследование комплексно, включая несколько анализов в одном пакете услуг. Например, «ПЦР-8», который включает в себя восемь бактериальных и вирусных возбудителей острых кишечных инфекций, обойдется в 1400 рублей, а «ПЦР-12», включающий 12 половых инфекций, - в 3500 рублей. Комплексное проведение анализов позволяет существенно сэкономить деньги, поскольку отдельное прохождение ПЦР-диагностики для каждой инфекции будет гораздо дороже.

Фото: freepik.com